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膏状浴盐菌落总数的测定及步骤探求

日期：2015-08-20 作者：本站编纂点击次数：

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提要：菌落总数作为判定化妆品被传染的水平标志，关系到产品的卫生质量及使用的安全性，本文针对膏状浴盐菌落总数的测定进行详述，并对今后化妆品菌落总数的检测步骤及方向进行探求和瞻望。

关键词：膏状浴盐菌落总数测定步骤探求

微生物的世界变动莫测、令人沉迷，它无处不在，存在于我们生涯的每一个角落，存在于产品出产的每一路工序中。由于膏状浴盐在出产过程中是先造成胶体、加盐后再造成膏体的，胶体系统有时会受到微生物的传染和降解，膏体系统偶然也会有耐盐菌存活，传染源蕴含原资料、造作过程、设备和操作人员等；产品包装的设计在膏状浴盐微生物传染中举足轻沉，其中广口容器最易受到传染；膏状浴盐的水分较粉状浴盐多，更易支持微生物的成长……由于浴盐制品自身是不再灭菌的，并且其出产原料通常也是不灭菌的，只是在出产中通过溶化原料时加和善半制品存放中照射紫表线来杀菌，因而，我们不成能100%地断根浴盐出产原料、设备、环境和操作过程中的微生物。只能通过质控和检测来削减微生物进入到产品中，将其节造在一个对出产和对消费者相对安全的水平。

一、检测主张

微生物是影响化妆品卫生安全的沉要指标，也是产品卫生质量合格与否的沉要标志。凭据权威检验部门的结论及多年来化妆品检测的数据分析：化妆品微生物检测指标中合格率较低的项目重要是菌落总数，其次为霉菌和粪大肠菌群，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌只是在个别化妆品中才会检出。绝大无数化妆品微生物不合格的原因是菌落总数超标，而较少或底子检测不出肠路细菌、真菌或致病菌。由此可见，影响化妆品质量的重要微生物指标是菌落总数，但同时它与其它菌之间存在着肯定的关联�；逼分芯渥苁蕉�，粪大肠菌群、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检出率也越高；反之，若是在某一样品中检出金黄色葡萄球菌、粪大肠菌群和铜绿假单胞菌，那么该样品的菌落总数注定会超过国标的有关划定。
随着人们对化妆品要求的不休提高，化妆品厂家在出产中增添了多种动植物原料和营养成份，为细菌的成长滋生创造了优良的前提。固然洗澡盐的重要成分是盐，盐拥有杀菌消炎的功效，但在膏状浴盐配方设计过程中思考到盐颗粒在胶体中悬浮的均匀性以及使用时泡沫是否丰硕等成分会将盐含量限度在一个相宜的领域中。只是洗澡盐与其它洗澡液相比，微生物成长的机遇极度幼甚至没有，但不能保障产品肯定是无菌的，必要通过制品微生物检测来判定。为及使仄握膏状浴盐在出产过程中的卫生质量与卫生安全，相识和核查出产中所选用原料、出产设备、工艺流程及操作人员的卫生情况，判定产品在出产过程中被微生物——细菌传染的水平，我们建议选取尺度平板计数法与TTC琼脂造就基法相结合来进行菌落总数的测定，以此作为改进出产工艺及判定制品卫生质量是否合格的凭据。

二、菌落总数的界说及检测道理

菌落的英文是（colony），界说为细菌和其它几种微生物在固体造就基上成长滋生而形成的能被肉眼识此外成长物，它是由数以万计的一样细菌荟萃而成的，故又有细菌集落之称。各类细菌的菌落各自拥有肯定的特点，按其特点的分歧能够在某种水平上甄别某种细菌，为微生物检验提供凭据。菌落总数系指检样经过表包装清洁消毒，样品称量、稀释等处置，在肯定前提下造就后（如造就基成分、造就温度、造就功夫、pH 值、需氧性质等），割裂成长成一个个肉眼或低倍显微镜下可见的细菌集落，并通过平皿计数，1g（或1ml）检样中所含菌落的总数。其造就的道理是指检样在被稀释到肯定浓度后，汲取肯定量的检样，检样中的细菌细胞和造就基均匀混合后，每个细菌细胞都形成一个肉眼可见的菌落的如果为基础的。由于各类化妆品中被传染的细菌种类分歧，如浴盐中会存在由海水或井下卤水带来的极少量的嗜盐菌、表表活性剂原猜中偶然夹带的枯草芽孢杆菌等，每种细菌都有它肯定的生理活性，造就时对造就要求，如温度、功夫蹬仔所分歧，而在现实检验工作中，不成能满足所有菌的造就前提，因而所测定的了局只蕴含在本方律例定的前提下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃造就48幼时）成长的一群嗜中温的需氧性菌落总数。厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，在该前提下难以滋天生长。即现实存在的菌落数大于检测出来的菌落总数。菌落总数并不能区吩熹中细菌的种类，有时也被称为杂菌数、需氧菌数等。

三、检测步骤

        菌落总数的测定是将被检样品造成几个分歧的10倍递增稀释液，而后从每个稀释液平别离取出1ml置于灭菌平皿中与TTC—卵磷脂吐温80营养琼脂造就基混合，在肯定温度下，造就一按功夫后（通常为48幼时），纪录每个平皿中形成的菌落数量，并凭据稀释倍数，推算出每克（或每ml）原始样品中所含有的细菌菌落总数。检验步骤拜见2007年版《化妆品卫生规范》。由于规范中的检测步骤是针对所有化妆品的，故本文在规范步骤的基础上，结合膏状浴盐的产品个性及检测的实际经验，对其菌落总数的测定进行了补充和注解，以供盐行业内浴盐微生物检测人员互换参考。
        根基操作通常蕴含：样品采集和造备－－稀释－－倾泻平皿－－造就48幼时－－计数汇报。
        （一）仪器和试剂
         1.仪器
        250ml三角瓶、200ml量筒、15×150mm试管、直径 9cm灭菌平皿、10ml、2ml和1ml灭菌刻度吸管、酒精灯、放大镜、pH 计或精密 pH 试纸、高压灭菌器、36℃±1℃恒温造就箱。
         2.试剂
         （1）灭菌蒸馏水
         成分：蒸馏水            1000mL
         造法：将蒸馏水分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶                90ml，103kPa（121℃ 15 lb）下高压灭菌20min。
         （2）卵磷脂吐温80—营养琼脂造就基
         成分：蛋白胨                 20.0g
         牛肉浸出粉或膏           3.0g
         氯化钠                          5.0g
         琼脂                             15.0g
         卵磷脂                         1.0g
         吐温80                        7.0g
        目前该造就基市上有售，不必要自行配造，采办时应选择技术力量强、通过质管系统认证的企业产品，造就基品牌要相对固定，不要时时更换厂家，以预防试验中因使用分歧厂商的产品所造成的误差，影响检验了局的正确性。由于造就基的原资料分歧，品牌出产商使用的原料蛋白胨质量较好、色彩偏浅，造出的造就基通明度高，菌落易分辨，个别厂商出产的造就基杂质较多，菌落与杂质较难分辨。建议到荆门华东医药股份有限公司或荆门微生物试剂有限公司等正规渠路采办。
        使用步骤：取本品51g于1000ml蒸馏水中，加热、搅拌至溶化，经121℃、20min灭菌后，冷却至45—50℃时，倾泻平皿备用（具体参照造就基上的使用注明）
       0.5％氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）
        成分：        TTC             0.5g
        蒸馏水                          100ml
        造法：溶化后过滤，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min 高压灭菌，装于棕色试剂瓶内，置4℃中冰箱备用。
       （二）样品的采集及造备
         1.供检样品的采集
        （1）所采集的样品，应拥有代表性，通常视每批浴盐数量的大幼，凭据产品尺度中的检验规定抽取相应数量的包装单元。由于膏状浴盐呈膏体粘稠状态，灌装前制品取样时不应集中一点，宜多采几个部位。
       （2）待检的浴盐，应严格维持原有的包装状态，软管、塑料罐等包装不应有破损，检验前不得打开，预防样品被传染。若包装表表有传染，检验前利用酒精棉花擦拭干净。
        （3）接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能实时检验，样品应存放在室温阴凉、干燥处，不需冷藏或冷冻。
        （4）特殊情况下，若只有一个样品而同时需做多种检验，如细菌、沉金属、理化等，则应先取出部门样品做细菌检验，再将渣滓样品做其它分析。
        （5）操作中必须佑装无菌操作”的概想，所用玻璃器皿必须是齐全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等用具也必须进行消毒处置。若是是出厂检验，利用75%酒精在包装开口处擦拭后取样。全数操作应在超净工作台或经过灭菌处置的无菌室内进行。
         2.供检样品的造备
        称取10g样品，加到装有玻璃珠和90ml蒸馏水并已灭菌的锥形瓶中，充分振荡混匀（如有均质器，均质1~2min成效更好），静置15min。取其上清液作为1:10的检液。若样品过于粘稠，可称取25g样品加到装有225ml蒸馏水和玻璃珠并已灭菌的锥形瓶中，以加大样品量来提高检样的代表性。
        3.样品的稀释
       （1）稀释液：样品稀释液通常是灭菌生理盐水，但对含盐量较高的膏状浴盐进行稀释时，可选取灭菌蒸馏水，以防检样稀释液氯化钠浓度过高抑造了细菌的成长。在每支15×150mm试管中吸入9ml蒸馏水，造作数量凭据样品的几多及稀释倍数而定，灭菌待用。
       （2）用1ml灭菌吸管汲取1：10稀释液1ml，沿管壁缓缓注入含有9ml灭菌蒸馏水的试管内，振摇试管混合均匀，造成1：100的稀释液，把稳吸管进出三角瓶或试管时，吸管口不触及瓶口、管口的表围部门。另取1ml灭菌吸管，按上述操作挨次，造成10倍递增稀释液，以此类推。苹叫样沉复此操作。
       （3）为削减样品的稀释误差，在进行陆续递增稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释杜爪更换一支吸管，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管表部粘附的检液溶于其内。
         4.倾泻造就
        （1）凭据样品被传染的情况估计，选择2—3个合适的稀释度，每个稀释度做两个平皿（苹叫样），汲取1ml选定稀释度的稀释液于灭菌平皿中。由于膏状浴盐含盐量较高，从以往的经验检测数据来看，选择1/10和1/100的稀释度比力相宜，但若是在浴盐中增长了较多的天然植物或中草药成分的话，选择1/100和1/1000的稀释度比力合适。
        （2）待检用的造就基应在45-50℃水浴内保温，倾泻时造就基温度过高会烫死部门不耐高温的细菌，使菌落总数检测了局偏低；过低琼脂易凝固结块而不能与检液充分混匀，且造就后的平皿不易计数。如无水浴，应以皮肤感触较热而不烫为宜。
        （3）将消融并冷却至45-50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂造就基倾泻到平皿内，倾泻量在12ml—20ml之间，以每皿约15ml为宜，造就基过厚会影响观察计数，太薄又易于干裂。倾泻时，造就基底部若有沉淀物，应将底部弃去，预防过多的杂质与菌落混合而影响计数观察。
       （4）为使菌落能在平板上均匀散布，检液参与平皿后，应尽快倾泻造就基并轻轻地水平晃悠平皿，使样品与造就基充分混合均匀。检样从起头稀释到倾泻最后一个平皿所用功夫不宜太长，通常不超过20min，以预防细菌有所殒命或滋生。
        （5）别离将营养琼脂造就基倾入加有1ml稀释液（灭菌蒸馏水）的灭菌平皿内作稀释液空缺对照、倾入不加样品的灭菌空平皿内作造就基空缺对照、倾入敞盛开置于无菌室操作台上的灭菌空平皿作空气空缺对照。造就基空缺对照能够预防培基中的杂质与细菌菌落产生混合、不易分辨的情况，以便计数时作对照观察�？掌ɑ肪常┛杖倍哉漳芄幻磕昙煅�2—3次，选取操作台面上对角线五点检测，而稀释液和造就基空缺对照最好每次都做。
        （6）待琼脂凝固后，翻转平皿，置 36℃±1℃造就箱内造就 48h±2h，取出推算平板内菌落数量，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
       （7）造就功夫规范上要求48h±2h，凭据屡次观察，由于膏状浴盐含有肯定量的盐分，检出的菌落总数较少，通常1/10只有个位数，1/100险些没有。在出产销售垂危的情况下，通过24h的造就也能够计数，只是造就48h后，菌落个头变得更大更显著而已，此时计数不易产生差错，但在正常情况下应按规范上要求的功夫造就。
       （8）为便于区别浴盐中的颗粒与菌落，可在每100ml卵磷脂吐温80营养琼脂中参与1ml0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，造就后菌落呈红色，而浴盐的颗粒色彩则无变动。
       （9）造就箱应维持肯定的湿度，琼脂平板造就48h后，造就基失沉不应超过15％。
         5.计数汇报
        造就到功夫后，点数菌落数。吓酌肉眼观察，必要时用放大5～10倍的放大镜查抄，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出统一稀释度各平皿成长的均匀菌落数，推算出原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行汇报。
       （1）达到划定的造就功夫后，应立即计数。若是不能立即计数，应将平板搁置于0－4℃环境中，但不得超过24h。
       （2）计数时应拔取菌落数在30～300之间的平皿，作为菌落总数计数的凭据。若有二个稀释度均在30～300之间时，则按规范要求以二者之比值决定，若比值幼于或蹬宗2则取均匀数，比值大于2则汇报其中稀释度较低的平皿的菌落数汇报之。
       （3）若所有稀释度的均匀菌落数均不在计数区间，如均大于300个，则应按稀释度最高的均匀菌落数乘以稀释倍数汇报之；如均幼于30个，则应按稀释度最低的均匀菌落数乘以稀释倍数汇报之。如菌落数有的大于300个，而有的又幼于30个，均不在30～300个之间，则以最靠近300或30的均匀菌落数乘以稀释倍数汇报之。若所有的稀释度均无菌落成长，则应按每g或每ml幼于10CFU汇报之。
       （4）分歧稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（统一稀释度的二个平板的菌落数应根基靠近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反景象，则应视为检验中的差错（膏状浴盐有时会出现逆反景象），不应作为检样计数汇报的凭据。若空缺对照平板出现菌落，则这次检测了局无效。
        （5）当平皿上有链状菌落成长时，如呈链状成长的菌落之间无任何显著界限，则应作为一个菌落计，如存在几条分歧起源的链，则每条链应按一个菌落推算，不应把链上成长的每一个菌落分隔计数。如有连成片状的菌落或花点样菌落舒展成长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数散布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。
        （6）当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但散布又很均匀，则可取平板的一半或1/4计数，再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。
        （7）菌落计数的汇报，菌落数在 10 以内时，按实罕见值汇报之，大于100时，选取二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法推算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来暗示。在汇报菌落数为“不成计”时，应注明样品的稀释度。
       （8）菌落的形成单元CFU，CFU是cotong forming units的英文缩写，意思是菌落形成单元数，鉴于化妆品检样的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状、成片花点样或成堆的大局存在，因而在营养琼脂出现的菌落能够起源一个细胞群，也可所以一个单个细胞，因而平板计数不汇报正确的活菌个数，而是以单元沉量、体积或表表积内形成单元数(CFU)汇报，CFU／g(m1)暗示每克或每毫升样品中含有几多个菌落形成单元。

四、检验步骤探求

        目前我国对化妆品划定一律按《化妆品卫生规范》（2007年版）进行检验，它较以前的《化妆品卫生规范》（2002年版）和《GB 7918.2化妆品微生物尺度检验步骤》（1987年版）有显著的改进。它的执行，对于进一步规范化妆品原料、出产、检验和包装拥有极度沉要的领导意思，但是由于《化妆品卫生规范》合用于所有的化妆品，其中有一些细节问题还必要补充和美满，探求如下：
        （一）菌落总数空缺对照的改进
         《化妆品卫生规范》中5.2要求的空缺对照重要为造就基空缺对照，该空缺对照上若是没有菌落成长,注明检测过程所用的造就基、造就皿蹬酌具的灭菌情况和检验的操作过程切合无菌要求；但若是有2个以上菌落成长，则需追加空缺对照平皿进行造就观察，以甄别和判定到底是造就基还是造就皿、吸管等用具可能存在的传染，如有可能则在解除传染之后沉新检测。为削减误差，建议在检测过程中：1）将造就基空缺对照由1个增至2个，使空缺对照的数量与检样每个稀释度测定的平皿数量( 均为2 个平皿)一致,这样能够更好地反映无样品时的细菌数量、反映用具和造就基的灭菌情况以及无菌操作情况；2）每次检测样品时增长稀释液的平行空缺对照，从而判断稀释液和试管的的灭菌情况；3）凭据无菌室的灭菌情况，每年进行数次环境检测，利于发现环境（空气）和检验环节中存在的问题，进而越发正确地测定样品的菌落总数。
        （二）中和检液的pH值
         由于化妆品在出产过程中使用的一些原资料呈酸或碱性，所以最终产品可能偏酸或碱性。固然无数出产厂家在制品前会将产品的pH值调至中性，但也有一些企业在产品中增添了一些职能性特殊原料，而这些原资料的功效必须在酸或碱性的环境中能力显露出来，因而，建议做菌落总数时，先测一下原液或稀释后检液的pH值，若原液很粘稠，无法直接测定pH值，可用1/10检液测定，发显熹偏酸或碱时，在原液或稀释后的检液植入平皿前将其调成中性，调中性的酸碱通常使用弱酸或弱碱，如冰醋酸或纯碱的稀释液等，不然在太酸或碱的造就环境下细菌是无法成长的，这样做会利于企业出厂检验的节造。只管一些酵母和霉菌可耐受酸性环境（pH<4），但通常细菌成长的pH值是在中性领域中，很多化妆品中的细菌都受到其不利pH值的抑造，如pH<4或pH>10。但随着pH值逐步远离中性，细菌在其中的成长能力也逐步减弱，在拥有极端pH值的酸或碱环境中，很难发现有细菌成长。
       （三）削减稀释引起的误差
        在检验中，由于化妆品中含有防腐剂、消毒剂及某些建复成分等，抑造了细菌的成长, 会造成分歧稀释度检出的菌落总数异常景象，而稀释后，灭菌生理盐水或灭菌蒸馏水等稀释液缓解了防腐剂、消毒剂的作用，细菌的生计环境有了肯定的改善, 使细菌起头成长滋生，出现了样品在第一稀释度无菌成长，而第二或第三稀释杜仔细菌成长（即稀释度高的菌落数反而比稀释度低的多）的情况。出现这种景象重要是防腐剂等化学物质，抑造了样品中细菌的成长。在稀释度高时，防腐剂的浓度低；稀释度低时，防腐剂浓度高，从而造成菌落总数的逆反景象，针对这种情况：1.可使用抗滋扰微生物造就基，其可分为抗防腐剂型、抗消毒剂型和抗臭氧型等。但抗滋扰微生物造就基的价值通常比通常造就基贵，且要有针对性地使用，不然会无效，并造成另表的滋扰。2.视样品分歧，不能一概使用灭菌生理盐水或灭菌蒸馏水作稀释液, 应在稀释液配造中参与适量的能中和防腐剂或抑菌剂的物质，以削减稀释带来的误差。
       （四）提高细菌总数的检出率
        细菌种类繁多，每种细菌都有它肯定的生理个性和造就要求，而在现实检测过程中，我们不成能做到满足所有菌的要求，只蕴含在肯定的前提下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃造就48幼时）成长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的细菌菌落总数。而现实上在所检样品中可能不止存在这些细菌。当我们在做试验钻研或想检出更多的菌种时，我们就要配造一种营养成分更全面、更丰硕而又极易被大无数微生物吸收利用的造就基。钻研资料显示，使用美国食品药品治理局(FDA)的尺度平板造就基(即每1000 ml造就基含胰蛋白胨5g、酵母膏2.5g、葡萄糖1g、琼脂 15g)测定细菌总数，比我们此刻国内使用的卵磷脂吐温80营养琼脂（即每1000ml造就基含蛋白胨10g、牛肉膏3g、Nacl5g、琼脂15g）均匀检出率高23.9%；另一种步骤就是对卵磷脂吐温80营养琼脂造就基进行改进，在原来成分的基础上别离增长0.1%葡萄糖和0.1%酵母膏，原因是该造就基没有提供初始纯碳源。造就基中的碳源、氮源均来自牛肉膏和蛋白胨，而葡萄糖是一种绝大无数细菌最易吸收利用的优良碳源，增长0.1%葡萄糖作为碳源对绝大无数细菌的初始成长是极为有利的。酵母膏营养丰硕，除提供大量B族维生素、蛋白质、氨基酸、核酸等碳源、氮源表，还提供矿物质以及谷胱甘肽、酶类、核酸等拥有生理活性作用的营养成分，增长0.1%的酵母膏利于绝大无数微生物的成长。
       （五）测定步骤瞻望
        随着微生物学和检测技术的发展，产生了很多关于菌落总数测定的新技术和新步骤，目前化妆品菌落总数测定的尺度步骤是平板计数法，其利益是能较好地反映菌落的疏密水平，沉复性和平行性较好，可获得活菌菌落信息，是经典的计数步骤，弊端是造就功夫长，必要配造造就基和洗濯、消毒造就器皿等大量辅助性工作，操作过程繁琐。相对于食品的直接入口而言，化妆品涂抹、喷洒于人体表表的个性，风险性要略幼一些，但在出产工作垂危的情况下，产品必要当天出货，选取规范的检测步骤48幼时获得的检测了局现实意思有限。由此，急剧检测技术应运而生，并由造就水平向分子水平迈进。目前重要利用于食品但也有部门利用在化妆品领域内的急剧检测技术有：1.生物电化学步骤：常见的有阻抗分析法、伏安分析法、电位电流分析法等；2.ATP生物发光法；3.滤膜法；4.量热法；5.流式细胞术；6.显微图像鉴别技术；7.固相细胞计数法；8.机械视觉法等。菌落总数是目前国内最常用的微生物检测项目，能否在最短的功夫内快捷、正确地反映样品的微生物数量，是我们微生物检测人员今后致力的工作方向，出格是近年来随着分子生物学、微电子技术及生物技术的发展，微生物急剧检验技术已有了很大的突破，今后ABPAY钱包官方网站步骤尺度肯定会越发便捷、正确、合理、全面！

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